სამეცნიერო და საგანმანათლებლო მეთოდები

სემინარები

1) საკალიბრო მრუდის აგება

საკალიბრო მრუდების აგების პროცესში, სტუდენტი სწავლობს ისეთ ტექნიკას როგორიცაა: გამზავება, გაზომვები და საკალიბრო მრუდების აგება. სტუდენტი იწყებს ისეთმნიშვნელობების გარჩევას როგორიცაა სტანდარტული ხსნარები და საკალიბრო მრუდი, რომელსაც კლასიკურად (იხ.ნახ. 1) აქვს სამი ზონა:

1) არამგრძნობიარე ზონა, იშვიათად გვხვდება რეალურ ექსპერიმენტში.
2) პირდაპირ პროპორციული ზონა (პირველი რიგის რეაქცია).
3) განსაზღვრის სკალის ზედა ზღვარს გადაცილებული მაჩვენებელი (ნულოვანი რიგის რეაქცია).

ზონა 1 , როდესაც მგრძნობიარობა არ არის საკმარისი ამა თუ იმ ნივთიერებების გასაზომად და ნივთიერების კონცენტრაციის მომატებით ოპტიკური სიმკვრივე ან არ იზრდება ან იზრდება არაპროპორციულად. ზონა 2 ეს არის პირდაპირ პროპორციული დამოკიდებულება რომელიც მათემატიკურად გამოსახება y=ax+b ეს არის სამუშაო ზონა-2 ან -1რიგის რეაქცია. სტუდენტს განემარტება რომ, როგორც ოპტიკური მაჩვენებელი, ასევე ნივთიერებებისკონცენტრაციების სხვადასხვა მაჩვენებელი არ უნდა აღემატებოდეს ამ ზონას. ნახაზი 1 დან ჩანს რომ კონკრეტულ ექსპერიმენტში OD მაჩვენებელიშეიძლება ვარირებდეს 0,6 -დან 1,7-მდე , აბსორციის მაჩვენებელი, და 1,1 დან 2,15-მდე კონცენტრაციები ან საკვლევი ნივთიერების რაოდენობა. ყველა მაჩვენებელი,რომელიც მიიღება ზონა ორის მაჩვენებლებზე მაღლა ან დაბლა არის არასწორი და არ გამოდგება გამოთვლებისთვის. ზონა 3, თუ მაჩვენებლები (საანალიზო ნივთიერებების) აღემატება ზონა ორის ზედა მაჩვენებელეს,მაშინ ეს მნიშვნელობა აღმოჩნდება მესამე ზონაში. ამ ზონაში ისევე როგორც პირველ ზონაში (გამომდინარე იქედან რომ ეს უბანი არის არაპროპორციული) მაჩვენებელი არ შეიძლება გამოყენებული იქნას გამოთვლებისთვის.



2) ბიოლოგიურად აქტიური ნივთიერებების კონცენტრაციების განსაზღვრა

პრაქტიკული შეიცავს მეთოდებს, რომელიც გამოიყენება ცილისა და გლუკოზის განსაზღვრისათვის ბიოლოგიურ ექსტრაქტებში (ამ შემთხვევაში რძის ჰიდროლიზატი და ჰიდროლიზატის კონცენტრატი) ცილისა და გლუკოზის მაჩვენებელი რძის ჰიდროლიზატში უნდა ჯდებოდეს მეორე ზონის ზღვრებში. გამომდინარე იქიდან, რომ ამ ზონაში დამოკიდებულება არის პირდაპირ პროპორციული გათვლები შეიძლება ვაწარმოოთ შემდეგ მეთოდებში: გრაფიკულად (გამოიყენება როდესაც საკალიბრო მრუდი არის სტაბილური და არ არის საშიშროება მისი შეცვლის), გაზომვა სტანდარტით (გამოიყენება როდესაც არის საშიშროება მრუდის შეცვლის ან მისი დახრის კუთხის შეცვლის). იმ შემთხვევაში თუ ოპტიკური მაჩვენებელი საანალიზო ხსნარის იმყოფება მეორე ზონაში გამოთვლები შეიძლება ჩატარდეს ქიმიური პროპორციის შესაბამისად. სადაცA-სანდარტული ხსნარის ოპტიკური მაჩვენებელი. O-შესაბამისი სტანდარტის კონცენტრაცია, A1-საძიებელი ხსნარის ოპტიკური მაჩვენებელი, X-საძიებელი ხსნარის კონცენტრაცია. მაგ: (იხ.სურ.1) სტანდარტული ხსნარის ოპტიკური მაჩვენებელი უნდა შეესაბამებოდეს 1,7. დავუშვათ რომ ოპტიკური მაჩვენებელი საანალიზო ხსნარის შეესაბამება 0,6- მაშინ პროპორციის თანახმად X = 0.6X2.15/1.7 მიღებული მნიშვნელობა X=0.75 შეესაბამება გრაფიკულ მაჩვენებლებს. გამოთვლებიფაქტორის (F) გამოყენებით (გამოიყენება იმ შემთხვევაში როდესაც სარეაქციო ხსნარი არის სტაბილური).ფაქტორით გამოთვლა არის გაიოლებული ფორმა გამოთვლის (სტანდარტის გამოყენებით), ვინაიდან გამოთვლაში ბოლო ფორმულა სტანდარტით წარმოადგენს X=A1xO/A, X=A1 სადაც O/A- არის პარამეტრები ცნობილი სტანდარტული ხსნარის და მარტივი გაყოფით ერთის მეორეზე ვიღებთ ფაქტორს, ანუ სტანდარტული ხსნარი იზომება ერთხელ, გასაზომი ნიმუშების სერიასთან ერთად. ფაქტორი გამოითვლება შემდეგნაირად (F)=O/A=F ნიმუშის მიღებული მნიშვნელობა მარტივად მრავლდება ფაქტორზე.
მაგ: (იხ.სურ.2)



იზომება სტანდარტული ხნსარის ოპტიკური მაჩვენებელი, რომელიც სავარაუდოდ შეესაბამება 2,15 მგ / მლ. სტანდარტული ხნსარის ოპტიკური მაჩვენებელი, უნდა შეესაბამებოდეს 1,7. ფაქტორის გამოთვლა ხდება შემდეგ ნაირად F=2,15/1,7, F=1,26. თუ დავუშვებთ იმას რომ საანალიზო ხსნარის ოპტიკური მაჩვენებელი შეესაბამება 0,6 მაშინ პროპორციის თანახმად X=0,6 ∙ F ანუX=0,6 ∙ 1,26 ანუ X=0,75. მიღებული მნიშვნელობა 0,75 შეესაბამება გრაფიკულ მაჩვენებელს და მაჩვენებელს რომელიც გამოთვლილია სტანდარტით. გამოთვლის სამივე ვარიანტი არის მართებული იმ შემთხვევაში თუ ექსპერიმენტალური მონაცემები იმყოფება მეორე ზონის ფარგლებში. კონცენტრირებული რძის ჰიდროლიზატის მაჩვენებლები ხვდებიან მესამე ზონაში. ამიტომ ეს სინჯი უნდა იყოს განზავებული ოთხჯერ ფიზიოლოგიური ხსნარით და გაიზომოს თავიდან. გამომდინარე იქიდან რომ სინჯი არის განზავებული ოთხჯერ მიღებული პასუხიც უნდა გამრავლდეს ოთხზე.
3) ენზიმოლოგია

3.1) ფერმენტ სუფსტრაქტული დამოკიდებულების განსაზღვრა მიქაელის მენთენის კონსტანტა (km)

ამ ეტაპზე სტუდენტს შეუძლია გაზომოს გლუკოზის კონცენტრაცია რომელიც არის საქაროზის ჰიდროლიზის პროდუქტი, ასევე ცილა ანუ ფერმენტი რომელიც არის სახაროზის ჰიდროლიზის კატალიზატორი. შესაბამისად შემოდის მცნება ფერმენტის. ამ შემთხვევაში ფერმენტს წარმოადგენს ინვეტაზა, რომლის სუბსტრქტი არის სახაროზა, მარა სტუდენტი ჯერ არ არის მზად, რომ განიხილოს აქტიობის მცნება ვინაიდან მან არ იცის დამოკიდებულება ფერმენტის [E] და სუბსტრატისა[S]. მთავარ პოსტუატს წარმოადგენს [S]=10Km. ამიტომ მანამ ჩვენ დავიწყებთ აქტიობის გაზომვას, სტუდენტმა უნდა შეძლოს (Km) გამოთვლა.ასევე მან უნდა გამოთვალოს სუბსტრატის კონცენტრაცია, დრო და ტემპერატურა, ანუ მან უნდა შეძლოს მოდელის შექმნა აქტიობის განსაზღვრისათვის და მხოლოდ ამის მერე გაზომილ მაჩვენებელს შეუძლია დაარქვას აქტივობა. იღება საქაროზის ჭარბი რაოდენობა, ემატება ფერმენტი და დროის მინიმალურ მონაკვეთში (დრო როდესაც წარმოიქმნება დეტექტირებადი პროდუქტი) ისაზღვრება გლუკოზა როგორც პროდუქტი. შემდგომ ცდებში ხდება სახაროზის განზავება ( ფერმენტის კონცენტრაცია და დრო არ იცვლება) მანამ სანამ არ მოხდება რეაქციის სიჩქარის შემცირება. როდესაც მიღწეულია ინვერტაზის რეაქციის სიჩქარის შემცირება სუბსტრაქტის შემცირების გამო, იგება გრაფიკირეაქციის სიჩქარის დამოკიდებულებისა და სუბსტრაქტის კონცენტრაციის. მიღებული დამოკიდებულება ასახავს მიქაელის მენტენის განტოლებას (იხ.ნახ.3).


მიქაელის მენტენის განტოლება გამოდის ფერმენტული რეაქციის საერთო განტოლებიდან: E + S ↔ ES ↔ E + P, სადაც E -ფერმენტი, S-სუფსტრაქტი, ES-ფერმენტ-სუფსტრაქტული კომპლექსი, P-პროდუქტი. როგორც ჩანს განტოლებიდან ფერმენტი უერთდება სუფსქტრაქტს, იმისათვის რომ წარმოიქმნას ფერმენტ-სუფსტრატული კომპლექსი, რომელიც გარდაიქმნება პროდუქტში, ხოლო ფერმენტის აქტივობა რჩება შენარჩუნებული. Km- მიხაელის მენტენის კონსტატა: გვიჩვენებს სუბსტრატის კონცენტრაციას როდესაც რეაქციის სიჩქარე შეესაბამება მაქსიმალური სიჩქარის ნახევარს (იხ.ნახ.4).



ეს ესევე შეიძლება განხილული იყოს როგორც ფერმენტ სუბსტრატული კომპლექსის სიძლიერე და ცნობილია როგორც აფფინური ბმა. განტოლება სადაც Km არის დაბალი გვიჩვენებს მაღალ აფფინურ ბმაზევინაიდან Vmax რეაქცია მიუახლოვდება უფრო ჩქარა. განტოლება სადაც Km აქვს მაღალი მნიშვნელობა ნიშნავს რომ ფერმენტი ვერ წარმოქმნის ეფექტურ ბმას და Vmax იქნება მიღწეული მხოლოდ მაშინ როცა სუბსტრატის კონცენტრაცია იქნება მაღალი იმისთვის რომ ფერმენტი გახდეს გაჯერებული. თუ ავიღებთ მიქაელის მენტენის უკუმაჩვენებელს ეს განტოლება შეიძლება გარდაქმნილი იქნას ლაინუვერ - ბერკის განტოლებაში. 1/V=Km/Vmax*1/s+1/V



ლაინურელ ბერკის გრაფიკი

განტოლება,რომელიც გრაფიკულად აისახება, როგორც უკუმაჩვენებლები მიქაილის მენტენის ფორმულის ორმხრივად ასევე შეიძლება დაერქვას მას ლაინუვერ ბერკის კოორდინატები 1/Vo გადაკვეთა y ღერძთან გვაძლევს მნიშვნელობას 1/Vmax და გადაკვეთა X ღერძთან გვაძლევს მნიშვნელობას 1/Km , ხოლო დახრის კუთხესგვაძლევს Km/Vmax. ლაინუვერ ბერკის კოორდინატები განსაკუთრებით მნიშვნელოვანია იმის დასადგენად თუ როგორ იცვლება ფერმენტის კინემატიკა, ინჰიბიტორის თანდასწრებით, კონკურენტული, არაკონკურენტული ან შერეული ინჰიბირების პროცესში. ლაინუვერ ბერკის დამოკიდებულებიდან შესაძლებელია გამოითვალოს მიხაილ მენტენის კონსტანტაKm. რომელიც მდებარეობს X ღერძის გადაკვეთაზე ექსტრაპოლაციის შემდგომ,გამომდინარე იმ პირობიდან,რომ სუბსტრატის კონცენტრაცია [S] უნდა იყოს ტოლი10Km ანუ [S]=10Km. ჩვენ ვითვლით სუბსტრატის კონცენტრაციას და ვაკეთებთ ცდის მოდელირებას,იმისათვის რომ შევძლოთ ფერმენტული აქტივობის განსზაღვრა, ამ შემთხვევაში ინვერტაზის.

3.2) ფერმენტ ინვერტაზის აქტივობის განსაზღვრა

ქიმიზმი:




ჩვენს მიერ შემოთავაზებულ კრებულებში Km რომელიც მიიღება ექსპერიმენტალურად უნდა ვარირებდეს ზღვრებიდან 15-20 შესაბამისად სუბსტრატის მაქსიმალური კონცენტრაცია ამ აქტივობისთვის უნდა იყოს 200მგ/მლ. სუბსტრატის კონცენტრაცია აღებული უნდა იყოს 200მგ/მლ ,ხოლო დრო აქტივობის განსაზღვრისათვის უნდა იყოს შერჩეული ისე, რომ მიღებული პროდუქტი (გლუკოზა) უნდა აღმოჩნდეს მეორე ზონაში (ამ შემთხვევაში შერჩეულია 10 წთ) მისი მაქსიმალური მაჩვენებლით. აქტივობა 1მლ ხსნარში შეიძლება გამოთვლილი იყოს შემდეგი ფორმულით:



OD -ოპტიკური სიმკვრივე ნიმუშის,T რეაქციის ჩატარების დრო 100 კოეფიციენტი,იმისათვის რომ გადავითვალოთ 1 მლ-ზე [Gluk.st] სტანდარტული ხსნარის კონცენტრაცია გლუკოზის, [Gluk.std.OD] გლუკოზის სტანდარტული ხსნარის ოპტიკური მაჩვენებელი. იზომება ცილის კონცენტრაცია,შეფარდება აქტივობის მლ-ში და ცილის კონცენტრაციის გვაძლევს ხვედრით აქტივობას Aხვ= A∙ U/Mg

3.3) ცილების გამოლექვისა და გამომარილების მეთოდების შესწავლა

ხვედრითი აქტივობის და საერთო აქტივობის შედარება ,ეს ყველაზე ხშირად გამოყენებადი მეთოდებია ენზიმოლოგიაში. გაწმენდის პირველ ეტაპზე გამოიყენება ან გამოლექვა ან გამომარილება. უმეტესად ეს არის დაკავშირებული ცილების ანუ ფერმენტების ფრანქიონირებასთან. ლაბორატიულ პრაქტიკულ მიზანს წარმოადგენს, გაცნობა გამოლექვასა და დალექვის მეთოდებთან.

3.4) საქაროზის ჰიდროლიზი

ერთ-ერთი ყველაზე ხშირად შემხვედრი ამოცანა ბიოტექნოლოგიაში, ითვლება ჰიდროლიზი. ამა თუ იმ პროდუქტის დასაშლელად,მისი საბოლოო პროდუქტის მისაღებად. ამ შემთხვევაში საკითხი შეიძლება დაყენებული იყოს შემდეგნაირად: საქაროზის მოშორება ხსნარიდან, წარმოების კუთხით პრობლემა შეიძლება ასევე მდგომარეობდეს შემდეგში: ფრუქტოზისა და გლუკოზის მიღება ცალ-ცალკე ან გლუკოზო-ფრუქტოზული სიროფის მიღება (ინვერსიული შაქრის), ასევე შეიძლება ეს საკითხი იყოს დაყენებული ანალიტიკურ ქიმიაში,საქაროზის რაოდენობრივი განსაზღვრისათვის. ყველა ზემოთ ნახსენები პრობლემები არის დაკავშირებული საქაროზის ჰიდროლიზთან. პრობლემები რაც შეიძლება შეიქმნას ამ პროცესში ეს არის ფერმენტის ინჰიბირება, მისი ინაქტივაცია და ა.შ. თვითონ საკითხის დაყენება ჰიდროლოზის პროცესისთვის მოიცავს ისეთი მაჩვენებლების შერჩევას როგორიცაა: დრო, pH,ტემპერატურა, და ფერმენტსუბსტრატული კონცენტენტრაციების განსაზღვრა და რაც მთავარია მაქსიმალური ჰიდროლიზის მაქსიმალური სიღრმის განსაზღვრა. ანუ რა პირობებში შეიძლება იქნას მიღწეული საქაროზის ტრანსფორმაცია ინვერსიულ შაქარში. შემოთავაზებულ პრაქტუკუმში ამოცანა დგას შემდეგნაირად, მაქსიმალურად გადავიყვანოთ საქაროზა ჰოდროლიზის პროდუქტებში, ფერმენტის მინიმალური დანახარჯით მივაღწიოთ საქაროზის მაქსიმალურ ტრანსფორმაციას პროდუქტებში და ასევე ეს უნდა მოხდეს მინიმალურ დროში. ამ ექსპერიმენტში ჩვენ ვთვლით, რომ ისეთი მაჩვენებლები როგორიცაა: pH, ტემპერატურა და ფერმენტის კონცენტრაცია უკვე შერჩეულია. გამოუცნობ პარამეტრად შეიძლება ჩაითვალოს დრო, რომლის განმავლობაშიც შერჩეული იქნება ფერმენტ სუბსტრატის კონცენტრაცია pH-4,5 , T-55°. ამ პირობებში, როგორ შეიძლება საქაროზის მაქსიმალური ჰოდროლიზის მიღება.


4) თხელშრიანი ქრომატოგრაფია (TLC)

თხელშრიანი ქრომატოგრაფია, ეს არის უბრალო, ჩქარი და იაფი პროცედურა, რომელიც ქიმიკოსს აძლევს საშუალებას თუ რამდენი კომპონენტისგან შედგება ესა თუ ის ხსნარი. თხელშრიანი ქრომატოგრაფია გამოიყენება ასევე იმისათვის, რომ დავადგინოთ შემცველობა ხსნარის. ეს პროცესი ხდება, როდესაც Rf ხსნარის ტარდება Rf უკვე ცნობილი ნივთიერებისა,სასურველია ერთიდაიგივე ფირფიტაზე. ფირფიტას წარმოადგენს მინა ან რაიმე პლასტიკური მასალის ფირფიტა, შესაძლებელია ეს იყოს ალუმინის (როგორც წესი სილიკონი ან ალუმინი). (ხსნარის ძალიან პატარა ნაწილი) რომელიც შეტანილი უნდა იყოს კაპილარის მეშვეობით,რომლის ანალიზიც უნდა ჩატარდეს, შეგვაქვს ფირფიტის ყველაზე დაბალ ნაწილში. ფირფიტა თავსდება გამხსნელის თხელ ფენაში,კამერაში, ქრომატოგრაფიის ჩასატარებლად ისე,რომ მარტო ფირფიტის ქვედა ნაწილი იყოს დაფარული სითხით. ხსნარი (ან ელუივენტი, იგივე მობილური ფაზა) ნელა მიიმართება ფირფიტაზე ზევით კაპილარული ეფექტის შედეგად. როდესაც გამხსნელი აღწევს ნიმუშის შეტანის ადგილს, დგება თანასწორობა ხსნარის ყველა კომპონენტისათვის. მოლეკულებსშორის,რომლებიც ადსორბირებულები არიან ფირფიტის ზედაპირზე და მოლეკულებსშორის რომლებიც იმყოფენია ხსნარში. პრინციპში ნივთიერებები განსხვავებულები იქნებიან თავიანთი ხსნადობის მიხედვით და იმ ძალით თუ რა ძალით არიან ადსორბილებულები ადსორბენტზე, ზოგიერთი კომპონენტები ელუივერულები იქნებიან ფირფიტის სიბრტყეზე უფრო მაღლა ვიდრე სხვები, როდესაც გამხსნელი მიაღწევს ფირფიტის ზედა ზღვარს მაშინ ფირფიტა იქნება ამოღებული კამერიდან, გამშრალი და დაყოფილი კომპონენტები შეიძლება დავინახოთ თუ ხსნარი არის შეფერილი. როგორც წესი ნივთიერებები არ არის შეღებილი, ასეთ შემთხვევაში გამოიყენება ულტრაიისფერი ნათურა. ფირფიტის ზედაპირი შეიცავს ფლუერიცენტულ საღებავს, რომელიც ანათებს ყველა იმ ნაწილზე სადაც არ არის ნივთიერება , ხოლო ადგილი რომელზეც არის ნივთიერება იმ ადგილას ნათება არ ხდება, რაც გვაძლევს ვიზუალიზაციის საშუალებას. Rf -დაკავების ფაქტორი, ან Rf -ეს არის დისტანსია რომელიც ამა თუ იმ ნივთიერებამ გაიარა ფირფიტაზე, რომლის შეფარდებაც ხსნარის მიერ განვლილ მანძილთან გვაძლევს Rf-ს. (იხ.ნახ.7)





მაგალითისთვის: თუ ორგანულმა გამხსნელმა გაიარა 2,1სმ, ხოლო გამხსნელმა- 2,8 მაშინ Rf ტოლი იქნება 0,75.





Rf ორგანული ნივთიერებებისთვის შეიძლება იყოს ერთი და იგივე სხვადასხვა ექსპერიმენტებისთვის, იმ შემთხვევაში თუ პირობები ქრომატოგრაფიის არ იცვლება:

•        გამხსნელების სისტემა
•        ადსორბენტი
•        ადსორბენტის სისქე
•        შეტანილი ნიმუშის რაოდენობა
•        ტემპერატურა

გამომდინარე იქედან, რომ ამ ფაქტორების დაცვა არის ძალიან ძნელი, ექსპერიმენტიდან ექპერიმენტამდე, ამიტომ როგორც წესი გამოიყენება მნიშვნელობების შეფარდებები,რომლებიც შეიძლება გამოთვლილი იქნას სტანდარტთან შედარებით, ანუ შეიძლება შევადაროთ Rf-ების მაჩვენებელი ორგანულ გამხსნელების რომლებიც ერთიდაიგივე ფირფიტაზე იქნებიან გაკეთებული ერთიდაიგივე დროს. რაც უფრო მაღალია Rf- ნივთიერებას მით უფრო მეტ ხანს იგი მოძრაობს თხელშრიანი ქრომატოგრაფიის ფირფიტის ზედაპირზე. თუ შევადარებთ სხვადასხვა ნივთიერებებს ერთი და იგივე ქრომატოგრაფიის პირობებში ნივთიერებები რომელთა Rf არის მაღალი ისინი არიან ნაკლებად პოლარულები,ვინაიდან იგი ურთიერთქმედებს სუსტი პოლარულის მქონე ადსორბენტთან ზედაპირზე და პირიქით თუ ცნობილია სტრუქტურა ნივთიერებების საანალიზო ხსნარში, შესაძლებელია ითქვას, რომ ნივთიერებები რომელთაც გააჩნიათ ნაკლები პოლარობა მათი Rf იქნება უფრო მაღალი, ვიდრე პოლარული ნივთიერებების. თუ სხვადასხვა ნივთიერებების Rf-ები ემთხვევა შესაძლებელია რომ ეს იყოს ერთი და იგივე ნივთიერება თუმცა ეს არ არის ამის დადასტურება, ხოლო თუ Rf-ები არის განსხვავებული, რათქმა უნდა ეს არის დარწმუნებით სხვადასხვა ნივთიერება. კიდევ ერთხელ ხაზი უნდა გაესვას იმას რომ ეს ტესტი უნდა იყოს ჩატარებული ერთ ფირფიტაზე, ერთი და იგივე დროს, რადგან სხვადასხვა ფირფიტაზე ჩატარებული ვერ მოგვცემს ზუსტ მონაცემს.

გელ-ფილტრაციული ქრომატოგრაფია

გელ ფილტრაციული ქრომატოგრაფია- ეს არის დაყოფა, რომელიც დაფუძნებულია მოლეკულებით ზომით დაყოფაზე,მას ასევე უწოდებენ მოლეკულურ საცერს ანუ ან ქრომატოგრაფიას შეღწევას გელში. გელ ფილტრაციულ ქრომატოგრაფიაში მუდმივი ფაზა შედგება ფოროვანი ბურთულებისაგან, ზუსტად განსაზღვრული ზომის. მუდმივ ფაზას გელ ფილტრაციისთვის, როგორც ამბობენ აქვს დაყოფის დიაპაზონი,რაც ნიშნავს დაყოფას მოლეკულური მასების მიხედვით ამ დიაპაზონის ფარგლებში. ცილები,რომლებიც არიან უფრო პატარები მათ შეუძლიათ შეაღწიონ ფორებში ბურთულების და როგორც ამბობენ ჩაერთონ მასში. ეს პატარა ბურთულები ასევე ეხებიან მობილურ ფაზას ბურთულებში და ფაზას ბურთულებს შორის და მათი ელუცია ანუ მათი გამოსვლა სვეტიდან ხდება გელ ფილტრაციის ბოლოში. დიდი მოლეკულური მასის მქონე ცილები არ ერთვებიან ბურთულებში. მათ აქვთ შეხება მარტო მობილურ ფაზასთან ბურთულებს შუა და ამიტომ მათი ელუცია ხდება თავდაპირველად. ცილები რომლებთაც აქვთ შუალედური ზომები,ისინი ერთვებიან - ანუ აქვთ საშუალება შეაღწიონ ბურთულების ფორებში. ამ შემთხვევაში ამ ცილების ელუცია ხდება დიდი და პატარა ცილებს შუა. განვიხილოთ ხსნარი შემდეგი შემცველობით: გლუტამადეჰიდროგენაზის მოლეკულური მასით 290 000, რძემჟავა დეჰიდროგენაზის მოლეკულური მასით 140 000, შრატის ალბუმინის მოლეკულური მასით 67 000, ოვალბუმინის მოლეკულური მასით 43 000 და ციტოქრომ c -მოლეკულური მასით 12 400. დაყოფა ხორციელდება სვეტზე გელ ფილტრაციის მეთოდით, რომელიც შევსებულია ბიოგელით P-150, რომლის დაყოფის დიაპაზონიც არის 15 000-150 000 -მდე. ცილების შეტანისთანავე გლუტამადეჰიდროგენაზა გამოდის პირველი ვინაიდან მისი მასა შეესაბამება ზედა ზღვარს, ამიტომ აღნიშნული ცილა არ აღწევს ბურთულებში და მას შეხება აქვს მხოლოდ და მხოლოდ ელიუვენტთან. შესაბამისად მისი ელუცია ხდება ე.წ. მკვდარ მოცულობასთან ერთად Vo. ციტოქრომ c შეესაბამება ქვედა ზღვარს და მთლიანად არის შეღწეული ბურთულებში, ამიტომაც მისი ელუცია ხდება ქრომატოგრაფიის ბოლოს. დანარჩენი ცილები, რომლებიც ნაწილობრივ არიან ჩართულები ბურთულებში მათი ელუცია ხდება , მათი მოლეკულური მასის შემცირების შესაბამისად. ეს დაყოფა შეიძლება იყოს გამოსახული განტოლებით:



სადაც Vr- ცილის შეკავების მოცულობა, Vo-მობილური ფაზის მოცულობა ბურთულებს შორის რომელსაც ხშირად ეძახიან მკვდარ მოცულობას, Vi- მობილური ფაზის მოცულობა ბურთულებში ე.წ. ჩართული მოცულობა და K-დაყოფის კოეფიციენტი (ხარისხი,როდესაც ცილას შეუძლია ჩაერთოს ფორებიდან მუდმივ ფაზაში, რომელთა ზღვარი მდებარეობს 0-1 მდე). ზემოდხსენებული ცილების ხსნარში დაყოფის კოეფიციენტი K გლუტამადეჰიდროგენაზასთვის იქნებოდა ტოლი 0- ის (რადგან ის არის ჩართული), K=1 შეესაბამება ციტოქრომ c -ს რომელიც არის მთლიანად ჩართული. და K შეესაბამება 0-დან 1-მდე სხვა ცილებს რომელთა მოლეკულური მასებიც მდებარეობს სვეტის დაყოფის დიაპაზონში. პრაქტიკაში გელ ფილტრაცია გამოიყენება ცილების დასაყოფად მოლეკულური მასების მიხედვით. ასევე ეს მეთოდი შეიძლება გამოყენებული იყოს,რათა გადაყვანილ იქნას ცილა ერთი ბუფერიდან მეორეში. მაგალითად: ცილა შეიძლება შეტანილი იყოს აცეტატურ ბუფერში pH 4.8, ხოლო ელუცია მოხდეს ტრის ბუფერით pH 8.0 . შესაბამისად ტრის ბუფერის გამოყენებით, როგორც მობილურის ფაზის ცილა ტოვებს აცეტატურ ბუფერს და გადადის მოძრავ ბუფერში ანუ ტრის ბუფერში. ვინაიდან მისი მოძრაობა სვეტზე ბევრად უფრო ნელია, ვიდრე ნატრიაცეტატური მოლეკულების, რომლებიც მთლიანად არიან ჩართულები ბურთულებში და მოძრაობენ ბევრად უფრო ნელა ვიდრე ცილა. შესაბამისად ცილა ასწრებსსაწყისი ბუფერის დატოვებას და გადასვლას მობილურ ბუფერში რათა ჩქარა იყოს ელუივურებული სვეტიდან.

იმუნნოქიმია

პრეტიპიტაცია
ეს მეთოდი გამოიყენება ცხოველებიდან აღებული იმუნური სისხლის (შრატის) შესამოწმებლად, იმუნუნიზაციის შემდეგ პრეციპიტაციის მეთოდით მოწმდება ანტისხეულების წარმოქმნა იმუნიზირებულ ცხოველებში. შედეგს წარმოადგენს პრეციპიტაციის ზონის წარმოქმნა ორ ლუნკა-ს შორის. პრეციპიტაციის ზონა. არის ანტიგენ-ანტისხეულის კომპლექსი, რომელიც წარმოიქმნება დიფუზიის შედეგად ლუნკებს შორის. დადებითი პასუხის შემთხვევაში შრატი მზად არის შემდეგი გადამუშავებისთვის ან გამოყენებისათვის.



ჩვენი კრებულების მეშვეობით სტუდენტები გაივლიან ზემოაღწერილი ლაბორატორიულ პრაქტიკას. მიღებული შედეგები მეტყველებს იმაზე თუ რა კვალიფიკაციის დონეს არის მიღწეული მაძიებელი. Doti -ინგლისურად ნიშნავს ,,წერტილს”,შესაბამისად დოტის მეთოდი ეს არის ნიმუშის წერტილოვანი დატანა ნიტროცელულოზურ მემბრანაზე. როგორც ნახ-2.-დან ჩანს ნიტროცელულოზაზე დააქვთ ანტიგენი (AG), რომელიც არაკოვალენტურად ებმება ნიტროცელულოზას. ანტიგენის დატანა ხდება წვეთით და ნიტროცელულოზაზე წარმოიქმნება წერტილი სადაც ზედაპირი იფარება არაკოვალენტურად. მიბმული ანტიგენით Ag-ით ნიტროცელულოზის თავისუფალი უბნები იგივე პრინციპით იფარება ალბუმინის (alb) 1%-იან ხსნარში ინკუბაციით. შემდეგ ეტაპს წარმოადგენს AG-ის ზონის შეღებვა, რისთვისაც ნიტროცელულოზის ფირფიტა ევლება კონიუგატის ხსნარში სადაც ანტიგენს (AG) სპეციფიურად ებმევა (AT) ანტისხეული და ბოლო იფერება პეროქიდაზის ხარჯზე სადაც სუბსტრატის სახით გამოიყენება (Dab) დიამინობენზიდინი. დიამინობენზიდინი ან 4-ქლორ ნაფტოლი,ეს ქრომოგენი დაჟანგვისას წარმოქმნის არახსნად კომპლექსს და იღებება პეროქსიდაზას თანაობისას,შესაბამისად ნიტროცელულოზურ მემბრანაზე მოთავსებულ ანტიგენს ღებავს.



დოტის მეთოდი ფართოდ გამოიყენება იმუნოქიმიაში და სამედიცინო დიაგნოსტიკაში, განსაკუთრებით ფართოდ გამოიყენება ხარისხობრივ ანალიზში, როგორც სხვადასხვა ვირუსების ასევე სხვა და სხვა ნივთიერებების მიმართ ტიტრის დასადგენათ. ბოლო დროს Dot-ის ტიტრით ხშირად ატარებენ რაოდენობრივ ანალიზსაც. დოტის უპირატესობაა მისი სიმარტივე და სპეციფიკურობა. დოტის მეთოდის შესრულებისას სტუდენტი ითვისებს მაღალი მგრძნობელობის და სპეციფიკურობის მეთოდს, ჩვენი კრებულების მეშვეობით სტუდენტები გაივლიან ზემოაღწერილი ლაბორატორიულ პრაქტიკას. მიღებული შედეგები მეტყველებს იმაზე თუ რა კვალიფიკაციის დონეს არის მიღწეული მაძიებელი. ამ მეთოდით სტუდენტი ეცნობა ELISA-ს მეთოდს, სადაც ხდება თანმიმდევრული დასმა ანტიგენის ან ანტისხეულის, ასევე თავისუფალი უბნების დაბლოკვა, რათა თავიდან ავიცილოთ ცრუ დადებითი პასუხები, ასევე ანტიგენის გატიტვრას, რაც აძლევს სტუდენტს საშუალებას გაიგოს ELISA-ს რაოდენობრივი მეთოდის პრინციპი.



ELISA-ს რაოდენობრივი მეთოდი ფართოდ გამოიყენება მეცნიერებასა და სამედიცინო დიაგნოსტიკაში. უმეტესად გამოიყენება ისეთ ანალიზებში როგორიცაა: ჰორმონების, ონკომარკერების და ვირუსების დიაგნოსტიკა. ეს მეთოდი ასევე გამოიყენება ფარმაკოლოგიაში, სოფლის მეურნეობაში, მეცხოველეობაში და კვების მრეწველობის ლაბორატორიებშიც. პირველ ეტაპზე მკვლევარი ახდენს AG-ის (იხ სურ.) არაკოვალენტურ დასმას ლუნკის ზედაპირზე. რაც ხდება სპეციფიკურ ბუფერში გახსნილი AG-ის ინკუბაციით. ბუფერი: PB,S; PH 6,2; 0,15M; t-2-8c; T-2სთ. აღწერილი ცდის შედეგად ლუნკის ზედაპირს ებმება Ag-არაკოვალენტურად. ზედაპირის თავისუფალი უბნები იბლოკება იგივე პრინციპით ალბუმინის ხსნარით ინკუბაციისას. ბუფერი: PB,S; PH 6,2; 0,15M; t-2-8c; T-2სთ. ამ ეტაპზე ზედაპირი, სადაც არ ზის AG, იფარება ალბუმინით, რაც გამორიცხავს კონიუგატის (შემდეგი ეტაპი) არასპეციფიურ ზედაპირზე დაჯდომას. ანუ კონიუგატი სპეციპიურად უერთდება ანტიგენს Ag-ს. კონიუგატის დასმა ხდება ასევე აპეციფიურ ბუფერში: PB,S; PH 6,2; 0,15M; t-2-8c; T-2სთ. რის შედეგადაც კონიუგატი აჯდება Ag-ს სპეციფიურად. გამომდინარე იქიდან რომ კონიუგატის კოვალენტურად მიბმული აქვს პეროქსიდაზა, ხდება ქრომოგენის (TMB) დაჟანგვა H2O2-ით და ხსნარის უფერული მდგომარეობიდან ფერადში გადაყვანა ფერმენტ პეროქსიდაზის (PX)-ის მეშვეობით. ჩვენი კრებულების მეშვეობით სტუდენტები გაივლიან ზემოაღწერილი ლაბორატორიულ პრაქტიკას. მიღებული შედეგები მეტყველებს იმაზე თუ რა კვალიფიკაციის დონეს არის მიღწეული მაძიებელი.

ელექტროფორეზი
ელექტროფორეზი არის მეთოდი, რომლის მეშვეობითაც ხდება მაღალმოლეკულური და საშუალო მოლეკულური ნივთიერების დაყოფა მასისა და მუხტის მიხედვით. ელექტროფორეზი შესაძლებელია იყოს წაყვანილი როგორც ნატიურ ასევე დენატურირებულ პირობებში, ნატიური ელექტროფორეზის შემთხვევაში გასათვალისწინებელია თუ რა ტიპის ელექტროფორეზს ვაყენებთ მჟავე ან ტუტე რაც დამოკიდებულია სინჯის მუხტზე, ვინაიდან სინჯი უნდა იყოს შეტანილი საწინააღმდეგო მუხტის მხარეს გელში. სინჯი მარტივად გადაგვყავს შესაბამის ბუფერში დიალიზის ან ულტრაფილტრაციის მეშვეობით და ხდება მისი შეტანა გელში. ხოლო დენატურირებულ პირობებში შესაძლებელია ნივთიერებების მასის დადგენა თუ პარალელურ ბილიკზე გატარებული იქნება წინასწარ ცნობილი მოლეკულური მასის მარკერები. დენატურირებულ პირობებში სინჯს ბუფერში ემატება SDS-ი. პრაქტიკულად ცილის მეოთხეული სტრუქტურა იშლება და მოცულობითი მოლეკულა გარდაიქმნება სწორხაზოვან მოლეკულად, სხვადასხვა მოლეკულური მასის მქონე პატარ-პატარა განშტოებებით, რომელსაც ყოველ 1.4 ამინომჟავაზე ებმევა 1 მოლეკულა SDS-ი და აძლევს უარყოფით მუხტს. სინჯის მერკაპტოეთანოლით დამუშავების შემთხვევაში მოლეკულებში ხდება დისულფიდური ბმების აღდგენა (გაწყვეტა) და ამა თუ იმ ნივთიერებების სუბერთეულებად დაყოფა. რაც შეეხება შეღებვას საღებავი დიფუზიის მეთოდით შედის გელში, ებმევა ცილას და ისევ დიფუზიის მეთოდით ხდება გელის გამოღებვა, იგივე სითხეში (საღებავის გარეშე). გელი გამოიღებება, ხოლო ცილა რჩება შეღებილი. ჩვენი კრებულების მეშვეობით სტუდენტები გაივლიან ზემოაღწერილი ლაბორატორიულ პრაქტიკას. მიღებული შედეგები მეტყველებს იმაზე თუ რა კვალიფიკაციის დონეს არის მიღწეული მაძიებელი.