.

  О Нас
  Каталог, Инструкции, Видео
  Биомедицина
  Информация о Продукции
  Семинары
  Свяжитесь с нами
  Рекламные Материалы
  Летняя школа
  Графики и Переводы Единиц  

                                             









Семинары

1) Построение калибровочных кривых

В процессе построение калибровочных кривых, студент обучается технике разбавления, измерения и построения графиков. Студент начинает понимать значение стандартных растворов и калибровачных кривых, которая классически (см. рис. 1) имеет 3 зоны:

1. Не чувствительная зона - редко присутствует в реальных экспериментах
2. Прямо пропорциональная зона (реакция первого порядка)
3. Зона зашкала (реакция нулевого порядка)

1 зона, когда не хватает чувствительности на то или иное соединение и с повышением концентрации соединения оптическая плотность либо не увеличивается, либо увеличивается непропорционально. 2 зона, это прямо пропорциональная зависимость, математически выражается y=ax+b . Эта зона, так называемая рабочая зона-2 - реакция первого порядка. То есть студенту объясняется, что как оптические плотности, так и концентрации различных соединений не должны превышать показатели зоны. Из рисунка видно, что во время конкретного эксперимента значения OD могут варьировать от 0.6 до 1.7 показателя абсорбции, и от 1.1 до 2.15 концентрации или количества исследуемого соединения. Все значения получаемые выше или ниже зоны 2 неверны для расчётов. Зона 3, если показатели (анализируемого соединения ) высше показателей, чем в зоне 2, значения оказываются в зоне 3. В данной зоне, как и в зоне 1 (в связи с тем, что не является прямо пропорциональной) не правильно высчитывать значения. В случае повышенныхэкспериментальных показателей, проба разбавляется до тех пор, пока показатели оптической плотности не окажутся в зоне 2.



2) Определение концентрации биологически активных соединений

Практикум включает методы определения концентрации белка и глюкозы в биологическом экстракте (в данном случае гидролизат молока, и гидролизат концентрата (сгущённого) молока). Значения показателей белка и глюкозы, в гидролизате молока должены оказаться во второй зоне. Учитывая, что в этой зоне зависимость прямо пропорциональная , можно проводить расчёты следующими методами: Графическое нахождение (применяется, когда калибровочная кривая стабильная и нет опасности её сдвига, также, когда экономится реактив). Измерения со стандартым раствором (применяется если есть опасность сдвига кривой или изменения угла наклона). Согласно данным стандартного раствора, если его OD находится, в зоне-2, то расчёт, проводится, химической - пропорцией:



где А - оптический показатель стандартного раствора, О - концентрация соответствующего стандарта, А1 - оптический показатель искомого раствора, Х - концентрация, искомого раствора. Пример (см. рис. 1). Значение оптической плотности стандартного раствора должна соответствовать 1,7 OD (см. рис1). Предположим, что OD -исследуемого раствора 0.6, тогда согласно пропорции, Х=0.6 X2.15/1.7. Получаемое значение Х=0.75 - соответствует графическому показателю. Расчёт с применением фактора F (применяется в тех случаях, когда реактив, очень стабилен). Расчет с применением фактора, является упрощённым методом расчёта, со стандартом так так конечной формулой в расчёте, со стандартом является Х=А1 * О/A гдеО/A-параметры известного стандартного раствора, и поделив одну на другую получаем фактор .-F т.е стандартный раствор измеряется один раз на серию замеров образца.расчитывается фактор (F) О/А=F. Полученое значение образца просто умножается на флакон (F). Пример см. рис. 1. Измеряется ОП стандартного раствора например .2.15мг/мл . Значение оптической плотности стандартного раствора должна соответствовать 1.7 ОП (см.рис.1). Рассчитывается фактор F=2.15/1.7, F=1.26. Предположим, что ОП-исследуемого раствора 0.6. Тогда согласно пропорции Х=0.6*F т.е. Х=0.6*1.26 т.е. Х=0.75. Получаемое значение 0.75- соответствует графическому показателю и рассчитанному со стандартом. Все три варианта подсчёта правомерны если эксперементальные данные находятся в зоне-2 см.рис.1. Показатели, концентрированной сгущённой сыворотки, должны оказаться в зоне 3. Поэтому данная проба разбавляется в четыре (4) раза физиологическим раствором и измерение производится заново. В связи с тем, что проба, разбавляется в 4 раза после проведения расчётов полученное значение, умножается на число разведений т.е. 4. Расчёты можно проводить любым из вышеописанных трёх методов.

3) Энзимология

3.1) Определение фермент-субстратной зависимости, и константы Michaelis-Menthen (Km)

Студент, на этом этапе развития, может измерить глюкозу, являющуюся продуктом гидролиза сахарозы, и белок, то есть фермент катализирующий реакцию. Соответственно вводится понятие фермента. В данном случае инвертазы, субстратом которой является сахароза. Но студент ещё не готов обсуждать активность, поскольку главная проблема взаимосвязи фермента [Е] и субстрата [S] для него ещё не ясна. Основным постулатом является взаимосвязь [S]=10Км. По этому прежде чем мы будем измерять активность, студент должен определить Км, рассчитать точную концентрацию субстрата, времени, температуры, т.е. должен смоделировать метод определения активности и только потом проводится измерения называемое активностью. Берется избыточная концентрация сахарозы, добавляетсяфермент, и за минимальный промежуток времени (время достижения максимальной детекции продукта ) измеряется глюкоза, как продукт. В последующих опытах, разбавляется сахароза (концентрация фермента, и время, не меняются) пока не начнёт уменьшатся скорость реакции. Достигнув показателей уменьшения скорости реакции инвертазы за счёт уменьшения концентрации субстрата, строится график зависимости скорости реакции от концентрации субстрата. Полученная зависимость, изображает уравнение Michaelis-Menthen (Km), (см. рис.2).



Уравнение Михаэлиса-Ментен возникает из общего уравнения для ферментативной реакции : E + S ↔ ES ↔ E + P , где Е-фермент , S-является субстратом , ES-является фермент - субстратного комплекса , а Р- является продуктом . Таким образом, ферментсоединяется с субстратом, чтобы образовать комплекс ES, который в свою очередь превращается в продукт , сохраняя при этом фермент. Km константа Михаэлиса- Ментена, который показывает концентрацию субстрата, когда скорость реакции равна половине максимальной скорости для реакции (рис.2). Это также можно рассматривать, как меру того, насколько прочен субстратный комплекс с заданной концентрацией фермента , иначе известный как его связывающая аффинность . Уравнение с низким значением Км указывает на большую аффинность связывания , так как реакция подойдет к Vmax быстрее . Уравнение с высоким Км означает, что фермент не связывается так эффективно и Vmax будет достигнута только тогда, когда концентрация субстрата достаточно высока, чтобы насытить фермент.
Принимая обратные значения с обоих сторон уравнения Михаэлиса- Ментена, получаем:



Чтобы определить значения КМ и Vmax уравнение Михаэлиса-Ментена может быть преобразовано в уравнение Лайнувера-Берка .



График Лаинвера-Берка

График уравнения обратных значений с обеих сторон уравнения также называетсяуравнением Лайнувера–Берка: 1/Vo от 1 / [S]пересечение с осью. У- дает значение 1/Vmax ;а пересечение с осью X - дает значение -1/KM ; а наклон Км/Vmax . График Лайнувера–Берка особенно полезен для анализа того, как меняется кинематика ферментов в присутствии ингибиторов , конкурентной , неконкурентной , или смесь того и другого. Из зависимости Лайнувера–Берка графически высчитывается значение Km. Из условия, что концентра ция субстрата [S] должна быть равна 10Km, то есть [S]=10*Km. Высчитываем концентрацию судстрата и моделируем опыт для определения ферментативной активности инвертазы.

3.2) Определение ферментативной активности инвертазы

Химизм:



В предлагаемых наборах, Км полученный экспериментально, долженварьировать в пределах 15-20. Соответственно максимальнаяконцентрация субстрата, для определения активности будет 200мг/мл. Берётся подсчитанная концентрация субстрата 200 мг/мл, а время для определения активности подбирается так чтобы полученный продукт (глюкоза) оказался в зоне-2 (в данном случае 10 мин) с максимальным показателем. Активность в мл раствора подсчитываем по формуле:



OD – оптическая плотность образца, T - время проведения реакции, (100) - коэффициент для пересчёта на (1) мл. [Gluk.st] - концентрация стандартного раствора глюкозы, [Gluk.std.OD] - оптическая плотность стандартного раствора глюкозы. Измеряется концентрация белка. Соотношение активности (мл), и концентрации белка, даёт удельную (относительную), активность, А (удельная) = А U/ml/мg/мl = А U/мg.

3.3) Обучение методом, осаждения белков, и высаливания

Сравнение общих и удельных активностей
Наиболее часто в энзимологии, на первых этапах очистки ферментов, применяют высаливание или осаждение.Чаще всего это связано с проблемами фракционирования и отчистки. Целью лабораторного практикума является ознакомление с методами высаливания и осаждения.

3.4) Гидролиз сахарозы

Одним из часто встречающихся задач в биотехнологии, является гидролиз того или иного субстрата до конечного продукта. В данном случае вопрос может быть поставлен следующим образом: убрать сахарозу, из раствора. С точки зрения промышленной проблемы, вопрос может стоять следующим образом: получить фруктозу, глюкозу или глюкозо-фруктозный сироп (инверсионный, сахар) проблемы, встречающиеся в аналитической области -провести, количественный анализ сахарозы. Все высше перечисленные проблемы связаны с гидролизом сахарозы. Проблемой может быть ингиби рование фермента, его инактивация и.т.д. Сама постановка этого вопроса, включает в себя оптимальный под бор оптимальных условий процесса гидролиза, то есть определение времени, pH и температуры гидролиза, определение концентрации фермента и субстрата и самое главное определение максимальной глубины гидро лиза. То есть при каких условиях происходит максимальная трансформация сахарозы в инвертный сахар. За дача в предлогаемом практикуме поставлена следующим образом: максимально перевести сахарозу в продук ты гидролиза, минимальным расходом фермента, добиться максимальной трансформации сахарозы в продук ты гидролиза, а так же в минимальное время добиться гидролиза сахарозы. В данном эксперименте мы априорно принимаем, что такие параметры как pH температура, концентра ция фермента, и субстрата подобраны оптимально. Вареабельным параметрам, оставляем вопрос времени, т. е. за какое время подобранная концентрация фермента и субстрат при pH -4,5, температура 55°, проведёт максимальный гидролиз сахарозы (в данном случае …..? часов).

4) Хроматография

Тонкослойная Хроматография (ТСХ)

ТСХ это простая, быстрая и дешевая процедура, которая позволяет химику определить сколько компонентов содержится в микстуре. ТСХ также используется чтобы установить идентичность состава в растворе, когда Rf состава сравнивается с Rfизвестного состава (желательно на одной и той же пластине ТСХ). Пластина поверхности ТСХ – это лист стекла, металла или пластика который покрыт тонким слоем прочного адсорбента (обычно силикон или алюминий). Маленькая часть раствора(вносится микролитры капилляром ), которую нужно анализировать наносится около нижней части этой пластины. Пластина ТСХ потом помещается в неглубокий слой растворителя в камеру для хроматографии, так чтобы только нижняя часть плоскости оказалась погружена в жидкость. Жидкость (или элюент та же мобильная фаза) медленно поднимается по плоскости ТСХ капиллярным эффектом. Когда растворитель поднимается за точку нанесения образца, наступает равновесие для всех компонентов раствора, между молекулами этого компонента, которые адсорбированны на поверхности и молекулами, которые находятся в растворе. В принципе, компоненты будут различатся по своей растворимости и силе адсорбции к адсорбенту, а некоторые компоненты будут элюированы выше по плоскости чем другие, когда растворитель достигает верхушки плоскости, пластина удаляется из камеры сушится, а разделенные компоненты раствора можно увидеть, если состав окрашен и это наблюдается легко. Обычно составы не окрашены в таких случаях используется ультрафиолетовая лампа. Поверхность пластины содержит флуоресцентную краску, которая светится везде кроме тех мест, где есть органический состав. Rf Фактор удерживания, или Rf, это дистанция пройденная веществом, разделенная на дистанцию пройденную растворителем.



Например, если органический состав прошел 2.1 см, а растворитель – 2.8 см, то Rf= 0.75:



Rf для органического состава сохраняется из одного эксперимента к другому только если следующие условия хроматографии также не меняются: Так как эти факторы трудно соблюдать неизменными от эксперимента к эксперименту, в основном учитываются относительные значения, которые определяются относительно стандарта, или это значит, что можно сравнить Rf органического состава, которые анализируются на одной и той же пластине в одно и тоже время. Чем больше Rf у соединения, тем дольше он идет по поверхности ТСХ. Сравнивая два различных соединения под идентичными условиями хроматографии, соединение с большим Rf менее полярный, поскольку он взаимодействует слабее с полярным адсорбентом плоскости ТСХ. Наоборот, если известна структура составов в растворе, можно предугадать, что состав с меньшей полярностью будет обладать большимRf чем полярный состав, который идет на той же плоскости. Вместе,Rf могут дать свидетельство об идентичности состава. Если идентичность состава подозревается но доказательств нет, аутентичный образец состава, или стандарт наносится рядом с исследуемым образцом на пластину ТСХ. Если у этих двух субстанций одинаковый Rf, тогда они возможно (но не всегда) одно и то же. Если у них разные Rf, тогда они точно разные. Обратите внимание, что этот тест должен быть проведен на одной и той же пластине, так как трудно воссаздавать все факторы которые влияют на Rf точь в точь от эксперимента к эксперименту.

Решение проблем ТСХ

Всё высше упомянутое может навести на мысль, что ТСХ –это простая и легкая процедура. Но как насчет первого раза, когда вы запустите ТСХ и увидите расплывчатые и неясные пятна? Как и с любой другой техникой, практика улучшит ваш навык. Ниже перечисленны некоторые проблемы, с которыми люди чаще всего сталкиваются во время ТСХ:
Гель-фильтрационная хроматография

Гель-фильтрационная хроматография- разделение, основанное на размере молекул. Это также называют молекулярным ситом или хроматографией проникающего геля. В гель-фильтрационной хроматографии постоянная фаза состоит из пористых шариковс четко определенным диапазоном размеров пор. У постоянной фазы для гель фильтрации, как говорят, есть диапазон разбивки, что означает, разделение по моллекулярным массам молекул в пределах того диапазона. Белки, которые являются достаточно маленькими, могут проникать во всех порах в шариках и, как говорят, включатся. Эти маленькие белки имеют доступ к мобильной фазе в шариках, а также мобильной фазе между шарикамии элюируются последними в гель фильтрации. Белки, которые являются слишком большими, для проникновения в поры, как говорят, исключаются. Они имеют доступ только к мобильной фазе между шариками и, поэтому, элюируют сначала. Белки промежуточного размера частично включены - они могут проникать в некоторых, но не всех порах в шариках. Эти белки тогда элюируются между большим ("исключенным") и маленьким ("полностью включенный") белками. Рассмотрим разделение смеси глутамат- дегидрогеназы (молекулярная масса 290,000), молочнокислойдегидрогеназы(молекулярная масса 140,000), сывороточного альбумина(MW 67,000), овальбумина (MW 43,000) и цитохрома С(MW 12,400), на колонке гель фильтрации заполненный Биогелем P-150 (диапазон разделения15,000 - 150,000). Когда смесь белков нанесенна на колонку, глутамат- дегидрогеназа элюируется первой, потому что его масса соответствует сверхнемупределу разделения. Поэтому этот белок полностью исключен из внутренней части пористой постоянной фазы и элюируется с пустым (мёртвым) объёмом (V0). Цитохром С ниже, более низкого предела разделения и полностью включен, поэтому элюируется в конце. Другие белки частично включены и элюируется в порядке уменьшения молекулярной массы. Эти разделения могут быть описаны уравнением:



где Vr- объем задержания белка, Vо - объем мобильной фазы между шариками постоянной фазы в колонке (иногда называемый пустым или мёртвым объемом), Vi- объем мобильной фазы в пористых шариках (также названный включенным объемом), и K- коэффициент разделения (степень, до которой белок может проникнуть через поры в постоянную фазу с пределами, располагающимися между 0 и 1). В смеси упомянутых выше белков коэффициент разделения (K) для глутамат дегидрогеназы был бы равен 0 (полностью исключен), K= 1 для цитохрома c(полностью включенный), и Kбудет между 0 и 1 для других белков, которые являются в пределах диапазона разделения колонки. На практике гель фильтрация может использоваться, чтобы разделитьбелки по молекулярным массам на любомэтапеочисткибелка. Это может также использоваться для буферного обмена - белок, растворённый в ацетатном буфере натрия, с pH 4.8, может быть внесён в колонку гель фильтрации, которая была уравновешена трис буфером,pH 8.0. Используя трис буфер, pH 8.0, как мобильную фазу белок покидает ацетатный буфер и переходит в трисмобильную фазу, поскольку двигаетсявниз по колонке, в то время как намного меньшие Na ацетатные молекулы буфера полностью включается в пористые шарики, и двигаются намного медленно, чем белок.

Ионнообменная хромотография

Ионно обменая хроматография - обратимая адсорбция, заряженных молекул, группамиионов на матрице противоположногозаряда. Разделение может бать селективным, что достигается адсорбцией и десорбцией образцов с матрицы. Обмен ионовначинается с уравновешивания обменника, используя pH и ионную силу. Во время уравновешивания ионогенные группы связаны со встречными ионами. Как только равновесие достигнуто, и образец внесён, молекулы с соответствующимзарядом, подвергаются адсорбциисовстречнымиионами и связываютсяобратимо с матрицей. Несвязанный материал проходит через колонку смёртвымобъемом. На третьей стадии вещества удаляютсяиз колонки,с увеличением ионной силы элюирующего буфера.

Ионнообменник - нерастворимая матрица с заряженными группами. Отрицательно заряженные обменники ковалентно пришиты и связывают положительно заряженные ионы (катионы). Обменники связывают один тип катиона, но, когда присутствует второй тип катиона, он может заместить, и/или обменять первый. Эти смолы называют катионообменными смолами. Смолы анионообменника заряжены положительно и связывают и/или обменивают отрицательно заряженные ионы (анионы). Несколько групп цепей в белках ионизированны – это ответвления на сторонах полимера остатками аминокислот (например, лизин или глутаминовая кислота), как N-терминальной, так и C-терминальной группы карбоксила,и таким образом считается, чтобелки - заряженные молекулы. Эта особенность может использоваться, чтобы разделить различные белки ионно-обменой хроматографией.

Два слабых обменника могут использоваться для разделения белков, карбоксинетилцеллюлёза (CM-целлюлоза) и диэтиланиноэтил - целлюлоза (DEAE-целлюлоза).Это ковалентно поперечно связанные шарикиагарозы и ионой целлюлозы были химическимодифицированны. У CM-целлюлозы есть карбоксиметил функциональная группа - CH2OCH2COO¯. В нейтральном pH карбоксиметиловая группа ионизирована как CH2OCH2COO¯ так, чтобы CM целлюлоза была отрицательно заряжена, таким образом, это - слабый обменник катиона. DEAE-целлюлоза содержит диэтиламиноэтиловуюгруппу. Это группа несёт положительный заряд в нейтральном pH и таким образом, DEAE-целлюлоза - слабый обменник аниона. Типы Sepharose особенно ипользуются для разделения белков с высокой молекулярной массой. На практике, так как эти матрицы очень похожииспользуемым для гель - фильтрации с гелем процесс ионного обмена может сопровождатся с процессом молекулярного просеивания. Это может или увеличить или уменьшить эффективность фракционированияпо сравнению с использованием целлюлозы как матрицы дляионного обмена. Фракционирование белков ионно обменойхроматографией зависит от различий заряда различных белков.

Зарядбелка зависит от числа и типа ионизированныхгрупп цепей аминокислот. Остатки лизина, имеют положительно заряженныегруппы, ответвляющихся на сторонах цепей, тогда как глутаминовые остатки заряжены отрицательно. У каждой стороны естьионизированные группы цепей с отличной pKa; то есть, pH , в котором всё это сумированно. Поэтому общее количество заряда в конкретном белке при конкретном pH будет зависеть от числа и типа ионизированныхгрупп цепейаминокислот. У различных белков различные составы аминокислот, они будут иметь тенденцию иметь различные зарядыв данном pH и могут фракционироваться на этой основе. У каждого белка есть изоэлектрическая точка (PI), где приопределенном pH общее количество отрицательных зарядов равняется числу положительных зарядов и таким образом, в данных условиях у данного белка нет заряда. (PI) изоэлектрическая точка белка. Когда белок будет при своём pH, белок не свяжетсяс ионообменной смолой. Ниже этого pH белок будет иметь чистый положительный заряд и свяжетсяс катионнобменником, и выше этого pH онбудет иметь чистый отрицательный заряд и белоксвяжетсяс анионнобменником. В принципе, или катионнобменник или анионнобменник, связывает белок. В практике белки стабильны и функционально активны в пределах довольно узких значениях pH, таким образом, выбор ионообменника часто диктует стабильное значение pH для конкретногобелка. Если белок стабилен в значениях pHниже его PI, должен использоваться катионообменник, если бы белок был бы стабиленв значениях pH выше его PI,то был бы выбран анионо обменник. Если белок стабилен по широкому ряду pH, то любой тип средынужно попробовать, и выбор зависит от лучшего разделения.Среда для ионного обмена, связываетионы с заряженными группами на смоле, ониназваны «встречными ионами». Для CM-целлюлозы встречный ион обычно - Nа +, и для DEAE-целлюлозы встречный ион обычно - Cl¯. После выбора соответствующей смолы егосмешивают с буфером, чтобы сформировать жидкий раствор, который вносят в подходящую хроматографическую колонку. PH этого стартового буфера крайне важен, так как онопределяет заряд вбелках, которые будут разделены. Стартовый pH буфера должен быть по крайней мере одной единицей pH выше или ниже PI белка, который будет гарантировать соответствующее закрепление связи белка со смолой. Однако примите во внимание, что CM-целлюлоза и DEAE-целлюлоза - примеры слабых ионообменников. Слабый ионообменник - тот, который ионизирован по только ограниченному ряду pH. Таким образом DEAE-целлюлоза начинает терять свой заряд выше pH 9, в то время, как CM-целлюлоза начинает терять свой зарядниже о pH 5. Термин «слабый» не относится к силе закрепления ионов к смоле, ни к физической силе смолы. Эффективный стартовыйдиапазон pH , используя DEAE-целлюлозу или CM-целлюлозу находится в пределах pH 5 - 9. Кроме того, чтобы правильно выбрать pH стартового буфера, нужно создать такие условия, что его ионная сила была бы довольно низкая, а аффинность белков к ионообменным смолам уменьшалась, когда ионная сила буфера будет возростать. Действительно эта свойство используется как один из методов элюирования ионно-связанных белков.

Flag Counter